Театр кукол открылся в Харькове 1 июля 1939 года. Свое первое представление труппа дала в тесной комнатке, снятой в аренду. В годы войны театр работал в эвакуации, а вернувшись в город, функционировал как передвижной — колесил по школам, колхозам и предприятиям. С приходом в 1952 году нового художественного руководителя Виктора Афанасьева жизнь творческого коллектива кардинально изменилась. В репертуаре появились интересные постановки для взрослых: «Божественная комедия», «Прекрасная Галатея» и многие другие. За более чем 70-летнюю историю театра было поставлено свыше 260 пьес. Сейчас в его репертуаре — 20 спектаклей для детей и 11 для взрослых. Это больше, чем в любом другом театре кукол Украины.
23 августа 1968 года труппа открыла сезон в новом помещении — здании бывшего Волжско-Камского банка, построенного по проекту Алексея Бекетова в 1908 году и переоборудованного под храм искусств архитекторами Б. Клейном и О. Любомиловой.
В помещениях театра есть ботанический и зоологический уголки, но основной достопримечательностью является единственный в стране Музей театральных кукол. Здесь собраны как местные «актеры на пенсии», так и многочисленные «гости» из разных стран мира. В нескольких залах музея можно не только увидеть марионеток, тростевых кукол, перчаточных, но и проследить многовековую историю развития театра кукол. В экспозициях также представлены афиши и декорации разных лет.
Сейчас Харьковский государственный академический театр кукол им. В. А. Афанасьева переживает очередной этап обновления. Благодаря тандему главного режиссера Оксаны Дмитриевой и главного художника Натальи Денисовой были созданы уникальные постановки для детей («Дюймовочка», «О принцах и принцессах») и взрослых («Простые истории Антона Чехова», «Король Лир»). На сегодня труппа театра считается одной из сильнейших в Украине. Здесь работают лучшие актеры и мастера по изготовлению кукол.